无菌检查和微生物检查的一些问题解答

1、问: 做无菌验证时阳性对照菌是怎么加入的？可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入吗？

答:严格的说是要在zui后一遍冲洗液中加入阳性对照菌的,这主要是考量滤膜对于阳性菌的截留性～但是滤器如果可以提供滤膜对于阳性菌的充分截留的话在zui后的培养体系中加入阳性菌也是未尝不可的. 如果供试品没有抑菌作用,可以在加完培养基后用无菌的注射器把菌液注入,摇匀如果供试品有抑菌作用,正如安哥洛卡所讲,在zui后一次冲洗液中加入阳性对照菌,摇匀,抽虑,加培养基. 无菌检查，加入阳性的方法可以有许多种，可以根据个人的习惯。只是注意：1、避免人为污染。2、阳性菌加入数量，关键词:阳性对照菌

2、问: 离心沉淀法的原理、操作和注意事项是什么?

答:原理:利用沉降系数的差异将供试品和微生物进行分离;

操作:取规定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量.

注意事项:真菌由于沉降系数比较小, 500r/min离心5min，黑曲霉、白色念珠菌回收率为20%,因此其检查不适宜用低速离心沉淀法.

关键词:离心沉淀法

3、问: 稳定性实验的微生物及无菌检查,是否每次都要做?

答:是;

原因: 一 实验期内可能会染菌;

二 灭菌后微生物并不是就*"死亡",有些成为碎片,这些碎片在一定的条件和时间下,可以自我修复而复活.

三 稳定性的考察，也应包括药品有效期的考察，在此期间所有的项目都应是合格的，无菌也是其中之一，如果在有效期内无菌不合格，也可以说明该药品存在一定的缺陷，至少，有效期有问题。

关键词: 稳定性实验

4、问:眼部给药制剂如何做卫生学检验?

答:液体制剂:无菌检查;

半固体及固体制剂:微生物限度检查

关键词: 眼部给药制剂

5、问:滴眼液的微生物限度为何进行无菌检查?

答: 一 滴眼剂产品系按照无菌工艺生产且终产品为灭菌产品,故其成品的微生物质量应要求统一为无菌;所以,滴眼剂产品的临床合理用药应与其卫生标准要求一致,即将其微生物质量要求统一为无菌,显然更为合理;

二 滴眼剂的微生物质量要求为无菌,是与各国药典在滴眼剂要求上的统一,及对《中国药典》此项规定合理性的补充及完善等方面看,滴眼剂成品的微生物质量要求统一为无菌具有必要性。

三 同时,中国已加入WTO,进出口药品已有明确质量要求(在国外药典中,眼用药品都以无菌要求),同时临床用药更加合理与规范。

故现行药典将滴眼剂的卫生标准统一为强制性无菌要求。

关键词: 滴眼液 无菌检查

6、问:如何进行灭菌验证?

答: 可用生物指示剂进行验证,

湿热灭菌:湿热脂肪芽孢杆菌孢子

干热灭菌:枯草芽孢杆菌孢子

7、问:为何洁净度沉降菌的检查只用营养琼脂?

答:一 玫瑰红钠培养基对细菌的生长有抑制作用,而营养琼脂对于真菌的生长则没有抑制作用,所以选用营养琼脂作为培养基

二 营养琼脂主要为培养细菌,而且培养时间是2天,原因为细菌为原核生物,生长与繁殖的能力较霉菌等真核生物强,所以控制了细菌,霉菌等真菌也在一定程度上也得到了控制

三 厂家在制定自己的内控标准时,可以同时对细菌和真菌进行控制.

关键词:沉降菌

8、问: 微生物培养时间范围如何界定?

答: 含量测定所允许的误差为±2%,如果照此限度,无菌培养时间为14天*24小时/天=336小时,它的2%为6.72小时,前后共13.44小时;又加上无菌检验没有必要达到含量测定所要求的精度,所以我们*可以在培养的第十四天的任何上班时间观察结果下结论.微生物限度检查培养时间分别为48小时及72小时, 它们的2%分别为0.96小时,1.44小时,即我们只能在准确培养时间的前后1~2小时内计数.

关键词: 微生物培养时间

9、问：抗生素乳膏，需加聚山梨酯80、司盘、单硬脂酸甘油酯乳化，后离心集菌（离心后不分层），再薄膜过滤。但基质堵住膜孔，过滤速度非常慢，怎么办？

答：1、可以用十六烷酸异丙酯萃取基质，使之分层，取水层进行薄膜过滤（回收率差）。

2、样品加入吐温-80，乳化（45度）-----薄膜过滤。

关键词：抗生素乳膏、十六烷酸异丙酯、萃取、吐温-80、乳化（45度）、薄膜过滤

10、问:陶瓦盖作用及使用范围

答:陶瓦盖的主要作用为防止菌落蔓延生长成片或发生重叠影响计数,通常在在效价测定中使用,在微生物限度检查中仅在易形成片状菌某些剂型如蜜丸、水丸中使用.

关键词:陶瓦盖

11、问:如何根据消毒物品的特性确定合格的灭菌时间和温度?

答:一般情况下，含有糖分的培养基温度需控制在115℃15～20min，不含糖分的培养基温度控制在121℃15～20min，而含菌的培养基（使用过）温度需控制在121℃30min左右 ，此外每次使用时，应放入必要的监视指标。

关键词:灭菌时间 温度

12、问:如何减少培养基灵敏度下降引起的误差? 答:目前大多数单位使用干粉培养基，使用较方便，但由于其极易吸潮，如存放不当出现凝块，则其凝固性较差，应避免使用。新鲜配制的培养基应在2℃～20℃避光保存，但不得冻结，保存时间不得过2周。硫乙醇盐流体培养基储存过程中，若氧化还原层超过1/5，须经水浴加热煮沸10min方可使用，但只限一次。否则可使培养基中糖、微生 物和氨基酸受到破坏，影响质量

关键词:培养基灵敏度

13、问:如何控制细菌的培养时间?

答:不同的培养时间对样品细菌总数计数结果的影响 样品经24h培养后，有的菌落很小，容易漏掉，培养48h后，菌落不但变大，而且还有很多新生长出来的菌落，培养72h后，菌落数增加不多，但菌落明显变大，而且混杂的霉菌生长旺盛，影响结果的观察计数。同时这也是一些样品经72h培养后细菌总数技术有明显增加的一个原因。培养24h和培养48h计数结果有明显差异，后者合格率明显降低，所以在规定的培养环境下，应严格遵守培养时间，以便真实的反映出样品中细菌总数的水平。

关键词:细菌 培养时间

14、问:菌种保藏与管理应执行哪些程序?

答:菌种保藏与管理应有完整的程序，保藏的菌种必须具备该菌种的详细历史及有关资料。一般是首先填写菌种卡片，登记菌种名称编号，来源历史，形态特征，生化与血清学鉴定，以及菌种传代次数、zui宜培养基和培养条件、保藏方法、贮存条件及保藏地址等

关键词:菌种保藏与管理

15、问:青霉素酶的保存条件及温度对其活性的影响　

答:青霉素酶能够在4℃保存6 个月以上活性不发生显著改变。与同时采用的加入甘油或增加氯化钠浓度保护酶活性的方法比较, 没有显著的不同;

温度对青霉素酶的活性影响很大。55 ℃时对青霉素G呈现zui高水解活性, 随着温度的升高或降低, 酶水解活性逐渐下降。缓冲液pH 对酶活性存在一定的影响, zui适酸碱度为 pH 7.0 ,在应用本酶进行青霉素制剂无菌检查等应用时, 需特别注意测试温度及酸碱度的影响.

关键词:青霉素酶 保存

16、问：标准灭菌时间

按F0=Ft * 10(t-121)/10计算，F0要大于8，在160--170度是短时间就能做到的，为什么干热灭菌要两小时以上呢？

答：湿热灭菌和干热灭菌的效果是不同的， 饱和蒸汽的穿透性比干热空气穿透强得多,蒸汽冷凝时放出的潜热传给待灭菌品,使之升温并使待灭菌品所带的微生物尤其是表面的微生物发生水合作用, 从而加速了它们的死亡。所以在达到同样灭菌效果的前提下,湿热灭菌所需要的时间要短得多。

（公式 F0=Ft * 10(t-121)/10 只适合于湿热灭菌 ,F0系T=121℃及Z=10℃下的FT值。如果把121℃理解为“标准状态”,那么F0可理解为“标准灭菌值”）

关键词：灭菌时间、湿热灭菌、干热灭菌

17、问：验证是不是要3批样品的一次，还是一批样品的3次，还是3次样品3次得实验？

答：1、验证的目的，是要考察实验方法的可行性（避免出现假阳性、假阴性），

2、在样品的药物组成、成份、给药途径一致的前提下，验证时，“同一个批号的做3次”或“3个批号的各做一次”，均可。

关键词：验证、3次、1次

18、问：做实验的好习惯是什么？

答：1.实验前后清洁洗手，完毕清理实验现场，器皿洗净归原，仪器等电源关闭。 2.试剂、样品标签详细准确，包括剂量，规格，时间，实验人员等等；实验记录详细准确，以便备查和分析。 3.提前分析实验内容及步骤，准备好全部的试剂及相应工具、仪器，不懂或者有疑问的步骤和地方问清楚，重点难点重点标出，做到心中有数；实验完毕及时分析。 4.科学计划、合理分配时间，做到忙而不乱。实验中仔细观察试验过程，及时记录可疑或者需要注意的地方。 5.多读文献多与别人交流，开拓思路，改进方案，对于实验的进展及方向做到一定的把握。

关键词：做实验、好习惯

19、问：限度检查所用器皿用自来水洗后一定用纯化水再洗吗?

答：GMP认证中关于QC的规程中"分析用玻璃器皿清洁规程"要求如下

1.0目的 提供玻璃器皿的清洁方法的文件指导。 2.0范围 化验室部门所有玻璃器皿。 3.0责任 化验室人员。 4.0程序 4.1 玻璃器皿每次使用后，使用者必须使其清洁并放于固定位置备用。 4.2 一般玻璃器皿清洁，用饮用水或去污剂洗涤后，器壁应不挂水珠，再用少量纯化水冲洗器皿三次，放固定位置自然干燥。 4.3 定量分析用玻璃器皿（如滴定管；移液管等）清洁，先把器皿内的水沥掉，然后往其中加入洗液，浸泡一段时间，放掉洗液，用饮用水冲洗后，再用纯化水冲洗三次，倒置自然干燥。 4.4 水分测定用的玻璃器皿清洁过程同1或2，清洁后置于105~107℃烘箱内烘干。然后存放于干燥器中。

关键词：限度检查、器皿、纯化水

20、问：洁净室甲醛气体熏蒸消毒验证方案是什么？

答：1、 甲醛消毒方法

在所有的消毒液中甲醛zui常用。当相对湿度在65%以上、温度在24~40℃时，甲醛气体的消毒效果，但若采用过多的甲醛，会因聚合而析出白色粉未附在建筑物或设备表面。一般甲醛的消毒方法如下：

A：消毒前先用丝绸浸注射用水（纯化水）擦洗房间建筑物和设备表面，然后用5%麝香草酚溶液喷酒或擦洗，静置1小时后，再用丝绸浸注射用水（纯化水）擦洗一次。

B：计算体积（包括房间及风管体积），按10ml/m3的比例准备浓度为36%的甲醛溶液（甲醛密度为1.1g/ml），按2~3g/m3的比例准备高锰酸钾溶液。

C：在房间中放入试验装置，如不锈钢培养皿支架；直径90mm双碟玻璃培养皿；枯草杆菌试纸，每张试纸上枯草杆菌数量为1*106个，每个培养皿中放2张试纸，1张做无菌试验，1张做含菌数试验。培养皿的数量应根据房间面积确定。

D：消毒流程：在不锈钢容器中加入高锰酸钾，用双层纱布盖住桶口，再倒入36%浓度的甲醛溶液 甲醛气体扩散（约30min） 启动空调器让甲醛气体循环（约20min） 关闭通风系统，房间熏蒸消毒，不少于7hr 房间排气，用新鲜空气置换（约2hr） 开启空调系统 用75%酒精喷酒环境。

E：质监部门取样培养。判断标准：试纸内枯草杆菌数量小于1*103个为合格。

F：取样后用丝绸沾0.1%的新洁尔灭溶液擦洗机器表面；用0.1%新洁尔灭溶液或1%Germ Warfare溶液或75%酒精喷洒建筑物四周。0.1%新洁尔溶液与1%Germ Warfare溶液溶液每月轮换一次。

2、 气体熏蒸灭菌后室内环境中残留量的测试

用甲醛气体进行熏蒸灭菌后，需用全新空气换气若小时，由于甲醛的环境标准只有（1~2）*10-6，要使环境中的残留的甲醛浓度尽可能低至不致使人嗅出特殊气味（<0.55*10-6>，并对眼睛无刺激（<1*10-6>，然后根据测定的室内环境中甲醛残留量的结果，正确设定换气时间，以保证在达到作业环境中无菌的前提下，对人身心健康不致产生不良影响。

（1） 取样方法及取样量

在各取样场所，用约30L的塑料袋收集室内空气，将袋内空气用吸收瓶、泵、气流计等组成的装置捕集至瓶内吸收液中（样本数应≧3）。

（2） 供试液的配制

取0.5%硼酸溶液20ml作为吸收液，用溶液吸收法，以1L/min的速度分别让各取样场所的空气通过10min，然后将吸收液移至25.0ml的容量瓶中，加水使成25.0ml，即得。

（3） 试验操作

A：取供试液2.0ml至带栓试管中，加5mol/L的NaOH溶液2.0ml及AHMT溶液2.0ml，轻摇数次混匀后，室温放置20min。然后加KIO4溶液2.0ml，摇2~5min至无气流生成为止；同时用水2.0ml同法制成对照液，在波长550nm附近测zui大吸光度。

B：分别取甲醛标准液0、0.5、1.0、1.5、2.0ml，加水使成2.0ml，然后按A操作，测定吸光度，制出甲醛浓度（ug/ml）与吸光度的关系检量线。

环境中的甲醛浓度（10-6）可由下式求出：

22.4 273+t

甲醛浓度（10-6）=aX-------------X25X---------

30.03 273V

式中 a------供试液中甲醛浓度，

V-----采样气体量，L

t-----采样时平均温度，℃

22．4-----1mol气体在0、1个大气压（101.325kPa）下的体积，L；

30．03---- 甲醛相对分子质量；

25-----供试液全量，ml。

（4） 试液准备

A：甲醛标准液

a甲醛稀释液：精取中国药典中规定“甲醛溶液”1ml,加水准确至200 ml作为甲醛稀释液.精取10ml至碘瓶内，确加入0.1mol/L碘液50ml，加1mol/L氢氧化锂溶液20ml。避光放置15min后，加15ml的10%硫酸，用硫代硫酸钠液（0.1mol/L）滴定。另用水10ml进行空白试验。

（Va-Vb）X1.5013

甲醛稀释液中的甲醛浓度（mg/ml）=------------------------------------

10

式中Va------甲醛稀释液消耗0.1mol/L硫代硫酸钠液量，ml；

Vb------空白试验消耗0.1mol/L硫代硫酸钠液量，ml；

1.5013------1ml碘液（0.1mol/L）相对甲醛的量，mg；

10-------甲醛稀释液取样量，ml。

b：甲醛标准液：精取甲醛稀释液，加水准确稀释1000倍，即得。

B：AHMT溶液

取4-氨基-3-肼-5-巯基-1，2，4-三唑0.5g，加0.2mol/L盐酸100ml溶解，避光保存。需要说明的是，用甲醛消毒时也有不加高锰酸钾，而将甲醛直接放入空调器内送入房间及用氨水中和的方法。不管采用什么方法，只要经过验证是可行的，都可以使用。

关键词：洁净室、甲醛气体、熏蒸消毒

问：细菌室工作守则（微生物室SOP之一）是什么？

答：细菌室工作守则 1.每日工作前用紫外线照射实验室半小时以上。 2.入室前应穿工作服，并做好实验前的各项准备工作。 3.实验室内应保持肃静，不准吸烟、吃东西及用手触摸面部。尽量减少室内活动，以免引起风动，无关人员禁入。 4.非必要物品禁止带入实验室，必要资料和书籍带入后，应远离操作台。 5.做好标本的登记、编号及试验记录。未发出报告前，请勿丢弃标本。 6.标本处理及各项试验应在操作间进行，接种环用完后应立即火焰灭菌，沾菌吸管、玻片等用后应浸泡在消毒液内。 7.实验时手部污染，应立即用过氧乙酸消毒或浸于3%来苏儿溶液中5-10分，再用肥皂洗手并冲洗干净；如误入口内，应立即吐出，并用1:1000高锰酸钾溶液或3%双氧水漱口，根据实际情况服用有关药物。 8.实验过程中，如污染了实验台或地面，应用3%来苏儿覆盖其上半小时，然后清洗；如污染工作服，应立即脱下，高压灭菌。 9.若出现着火情况，应沉着处理，切勿慌张，立即关闭电闸，积极灭火。易燃物品（如酒精、二甲苯、乙和丙酮等）必须远离火源，妥善保存。 10.工作结束时检查电器、酒精灯等是否关闭，观察记录培养箱、冰箱温度及工作情况，用浸有消毒液的抹布将操作台擦拭干净，并将试剂、用具等放回原处，清理台面，未污染的废弃物扔进污物桶，有菌废弃物应送高压灭菌后处理。 11.离室前工作人员应将双手用消毒液消毒，并用肥皂和清水洗净。 12.爱护仪器设备，经常清洁，注意防尘和防潮。 关键词：微生物室SOP

问：紫外灯管是什么玻璃材料做的？原理是什么？

答：紫外线杀菌灯基本常识 --------------------------------------------------------(彭*) ----杀菌灯实际上是属于一种低压汞灯。低压汞灯是利用较低汞蒸汽压（<10-2Pa）被激化而发出紫外光，其发光谱线主要有两条：一条是253.7nm波长；另一条是185nm波长，这两条都是肉眼看不见的紫外线。 ----用来照明用的日光灯、节能灯也属于低压汞灯，依*低压汞蒸汽被激发后发射紫外线，其中254nm波长的紫外线照射到荧光粉上再发出可见光，如果改变荧光粉的成分和比例，它就可以发出我们通常所见的不同颜色的光。 ----杀菌灯不需要转化为可见光，253.7nm的波长就能起到很好的杀菌作用，这是因为细胞对光波的吸收谱线有一个规律，在250~270nm的紫外线有zui大的吸收，被吸收的紫外线实际上作用于细胞遗传物质即DNA，它起到一种光化作用，紫外光子的能量被DNA中的碱基对吸收，引起遗传物质发生变异，使细菌当即死亡或不能繁殖后代，达到杀菌的目的。 ----日光灯和节能灯使用普通玻璃做成的，253.7nm紫外线透不出来，不能用做杀菌用的灯，石英玻璃对紫外线透过率高，达90%，是做杀菌灯的材料，但是石英玻璃的性能与普通玻璃在性能上有很大的差别(主要是热膨胀系数不同)，封接不能用普通的自动化程度较高的圆封的办法，这使得杀菌灯生产制造的技术含量要高于普通节能灯。 ----有一种透紫外线的玻璃，即通常所说的高硼玻璃，它对紫外透过率约是石英玻璃的60%，它的生产工艺与节能灯一样，使得它的成本与价格比石英玻璃生产的杀菌灯相差很远，几瓦的灯管只需几元，但它在性能上远比不上石英杀菌灯。表现在如下几方面： ---- 1、透过率不同，在同样规格经同样镇流器测试，石英玻璃杀菌灯紫外线强度是高硼玻璃杀菌灯的1.5倍以上； ---- 2、高硼玻璃灯紫外光强度很容易衰减，它点灯数百小时后其紫外光强度就大幅下降，降到初始时的50%-70%。在用户手上，虽然看到灯管还是亮的，但它可能已不起作用了。而石英玻璃的光衰减程度要远小于高硼灯，如果生产工艺过关，石英灯的光衰减在经点灯2000-3000小时，光衰减到初始时的80%-70%，以后只要灯不灭，光衰的幅度会越来越小。 ----国内杀菌灯的客户可能会了解菲利浦的杀菌灯，菲利浦有一种杀菌灯是用一种接近普通玻璃的玻璃生产的，而非石英玻璃制造的，其透光率接近石英玻璃的透过率，比中国的高硼玻璃灯要高得多，可使用自动化程度较高的节能灯生产工艺生产，这种灯主要依*他们炼制这种玻璃的技术。它的缺点是不能产生臭氧。 ----石英杀菌灯的另一个特点是可发出臭氧。由于石英玻璃对短波185nm的紫外线透过率也高，185nm的紫外线能电离空气产生臭氧，臭氧浓度高对人体不利，但在无人场合时能使用，臭氧也能杀菌、消毒，恰好可弥补由于紫外线只沿直线传播、消毒有死角的缺点。 ----有些场合不能有臭氧，也可使用石英杀菌灯，这种石英玻璃在炼制的时候就加了一种元素--钛（Ti），使它透过紫外线在200nm以下发生截止，而对254nm紫外线透过基本无影响，即通常所说的无臭氧杀菌灯。 ----从以上分析，做杀菌灯用石英玻璃是选择。在国内，医疗卫生领域，早已不使用高硼杀菌灯，在美国、加拿大、日本生产紫外线杀菌灯普遍都采用石英玻璃。原理：现代紫外消毒技术是基于现代防疫学、光学、数学、生物学及物理化学的基础上，利用特殊设计的率、高强度和长寿命的C波段紫外光发生装置产生的强紫外C光照射流水、空气或固体表面，当水、空气或固体表面中的各种细菌、病毒、寄生虫、水藻以及其他病原体受到一定剂量的紫外C光辐射后，其细胞中的DNA结构受到破坏（键断裂，或光化学反应，如使DNA中THYMINE二聚等），从而在不使用任何化学药物的情况下杀灭细菌、病毒以及其它致病体。达到了消毒和净化的目的。

关键词：紫外灯管

问:直接接种法和薄膜过滤法的区别

答:直接接种法取样量少,方法繁琐,且易受外源性细菌污染,对操作者和操作环境要求高,对实验结果的可*性影响较大。薄膜过滤法采用大取样量集菌的方法,具有代表性,不易漏检,仪器操作简单。该系统是全封闭过滤系统,避免了操作过程中外源性细菌的污染,对实验结果的可*性影响较小。薄膜过滤法的缺限是集菌仪的价格较高,一次性使用的集菌培养器也是一项支出,所以较直接接种法而言,花费的成本要高。相对产品质量而言,增加这点投入也是应该的。

关键词:直接接种法 薄膜过滤法 区别

问:05版药典关于微生物限度检查验证方法中提到验证试验至少应进行3次“独立的平行试验”。请问应该如何理解“独立的平行试验”？什么样的情况算是“独立平行”呢？如果设计3次试验，试验时间能否重叠？试验条件能否共用？

答:时间可以重叠,试验条件也可以共用.先做一次独立的试验,然后后面两次跟*次一样. (1）试验组：取样品加入xxx ml稀释液中，混匀制成供试液，取供试液1ml和1ml50～ 100cfu试验菌，注入无菌平皿中，做2个平行。（2）菌液组：取1ml试验菌注入无菌平皿中，做2个平行，测定所加的试验菌数。（3）供试品对照组：取1ml供试液注入无菌平皿中，做2个平行，测定供试品本底菌数。（４）倾注已融化并冷却至45℃左右的xxx培养基于以上平皿中，待凝固后，倒置于xxxx℃培养 xxxh，计数。（５）试验重复３次。

关键词:独立的平行试验 微生物限度检查验证