无菌隔离器的应用

一、简介

自2010版GMP实施以来，隔离技术已经在无菌制剂的生产中得到了广泛的应用。而2015版药典的讨论稿中，虽然在《无菌检查法》中取消了对无菌检查执行的环境的明确规定，但是将隔离技术在无菌检查中的应用引入了药典，增加了《无菌检查用隔离系统验证指导原则》。可见在中国，无菌检查隔离器将成为一个的新趋势。

从企业的成本角度来讲，一方面，隔离器的使用从根本上有效的控制了假阳性的发生，避免了由于假阳性造成的企业损失和企业声誉影响。另一方面，使用无菌检查隔离器不但降低了无菌检查操作环境的洁净级别，而且简化了人员进出的更衣过程，节省了背景环境的验证、日常消毒等额外的工作量。

然而，隔离技术在中国还是较新的技术，对于大多数中国制药企业来说，对无菌检查隔离器比较陌生，尤其不知道应该如何使用，以及使用中应该注意什么。本文结合了一些国内外的案例，就无菌检查的实际使用进行了说明，以及对隔离器的操作和日常检查提出了建议。

二、无菌检查隔离器的应用

实验室级别

就法规的角度而言，在《中国药典》2015年版通则微生物内容第三次公开征求意见的通知中的《无菌检查用隔离系统验证指导原则》：“建议不低于我国现行GMP中D级空气洁净度要求，……”

而国外主流法规，PIC/S，USP等均不要求无菌检查隔离器的背景环境级别，仅要求对进入的人员进行控制。

从作者的角度理解来看，无菌检查zui根本的目的是将药品中真正的阳性检查出来，用隔离器的目的是避免假阳性，因此，背景环境究竟是D级还是CNC，对于这个根本目的并不矛盾，不必要过多纠结在这个问题上。

作者所在的公司曾多次在生产车间环境下，在隔离器中进行无菌检查试验，未发生假阳性。

2. 隔离器选择步骤

2.1 明确隔离器的类型

目前主流的主要有两类无菌检查隔离器：紊流的塑料软舱体隔离器和单向流不锈钢硬舱体隔离器两类。

(1) 紊流的塑料软舱体隔离器

这种隔离器是世界上zui早发明的隔离器之一，其优点是轻便，便于移动。由于材料是透明的，操作时的光线较好。缺点是软质的材料表面清洁擦拭不便，使用一定时间由于消毒灭菌，塑料材质会老化变色。较硬舱体而言容易造成破损。在进行汽化过氧化氢灭菌的过程中，PVC材质容易吸附过氧化氢，从而造成通风时间过长。另外隔离器内压差不易稳定控制。虽然法规上对无菌检查隔离器的气流形式要求紊流和单向流均可，但是越来越多的用户倾向于选择使用单向气流。

(2) 单向流不锈钢硬舱体隔离器

和塑料软舱体隔离器相比，不锈钢硬舱体隔离器重量较重，设备成本较高。但是设备的材料强度，使用寿命比软舱体长。对于灭菌消毒剂耐受性好，易清洁，工艺适应性强。泄漏率更易保证。

2.2 隔离器的容积

在隔离器的选用中，如何选择与自身测试批量相匹配的容积的隔离器很重要。一般隔离器供应商会生成标准规格的隔离器（如下图所示），适用于常规无菌药品（如大输液、西林瓶、安瓿瓶、滴眼剂等）10~15批次的摆放容积。

用户应首先明确列举每日的测试量所用供试品的数量、包装、尺寸规格，以及培养基、缓冲液的数量包装和尺寸规格。并考虑日常工作排班情况选择合适的隔离器容积，确保隔离器能装载相应的物料，同时不影响灭菌效果。如下图所示为装载后的隔离器腔体。

2.3 人体工程学

无菌检查一般操作都会在4~5小时或者更长，因此合理的人体工程学设计会减轻操作者的长时间的疲劳，以及操作的便利性。

一般隔离器供应商会对标准规格的隔离器进行人体工程学设计，从设备的高度，手套的位置，操作平台的高度，操作视窗的尺寸，集菌仪与手套口的相对位置等进行考虑能适应多数操作人员的需求。下图举例说明了在人体工程学上相应的尺寸要求：

3. 无菌检查在隔离器中的操作过程

3.1 装载

首先准备好所有需要放入隔离器中的供试品、培养基、缓冲液、过滤罐以及相应的工具。按照经过验证的装载方式放入隔离器中。一般过滤罐会悬挂在隔离器上方的挂钩上，供试品、培养基和缓冲液会放置在有间隙的层架上，物料之间不能紧贴在一起，避免灭菌死角。

装载后关闭隔离器门，并且检查隔离器门是否关好，通隔离器是否显示报警。过目测或者使用手套检漏仪对隔离器的手套完整性进行检查。

3.2 灭菌

按照经过验证的灭菌参数，运行隔离器的灭菌循环。根据舱体大小、装载情况以及房间环境，灭菌周期时间在1.5~2.5小时。循环结束后检查过氧化氢在箱体的残留浓度，或者读取在线过氧化氢低浓度探头的读数。

3.3 整理物料

将灭菌后的隔离器中的物料按照操作习惯进行重新调整。以便于戴上隔离器手套后能够拿到所需的物品。

3.4 环境检测

在隔离器的使用过程中需要对环境进行监测，一般隔离器内部集成有在线的粒子计数器，以及浮游菌采样装置。另外在隔离器的操作平面上要放置沉降菌的培养皿。在手套手指、手掌、仪器、包装等表面进行表面微生物取样，待测试完成后传递出进行培养。

3.5 根据药典方法进行无菌检查。测试完成后，建议再对手套的手指、手掌部分的表面进行微生物取样。

3.6 转移培养罐和清场

对于每天一次的测试，可以直接打开隔离器门，取出培养罐。如果是连续式的排班，则可以通过传递窗或者其他无菌转移方式将培养罐传递出来。对于使用完的供试品包装、培养基和缓冲液的包装等可以打开隔离器门或者从传递窗转移出来。

3.7 隔离器的清洁

隔离器在使用后需要进行清洁，一般使用酒精或者异丙醇等对隔离器内部进行擦拭。擦拭的原则是从上到下，从后到前的顺序。在擦拭时如果隔离器体积较大，可以使用的清洁工具对隔离器内部进行清洁。

3.8 连续使用隔离器

对于连续批次的无菌检查，隔离器的主箱体门不开启，通过传递箱或者另一个箱体将灭过菌的物料传递至主箱体中。在这种应用时，更应该加强对隔离器内部微生物的检测。确定主箱体灭菌的zui低频率。

4. 隔离器的手套

无菌检查的操作对手套的使用操作频繁，工艺过程中常常会用到剪刀、针头或注射器，包括西林瓶铝盖的开封口，这些都会增加手套破损和加速老化。尤其是在手指部分。因此手套的完整性需要在操作前后进行检查。

手套的检查方法有两种：

(1)目测是zui简单，也zui便利的测试方法。一般将手套zui容易损坏的部位进行适当的拉伸，检查是否有明显破损。同时检查手套是否有龟裂、老化现象。

(2)手套检漏仪，利用保压法来对手套进行检查。

手套的完整性检查需要日常记录。

通常在佩戴隔离器手套之前，操作者会先佩戴一层无菌手套。在国外的实际应用中，有的操作者会在隔离器的手套外再戴一副无菌手套。下图为在隔离器的手套上在戴一层无菌手套。

手套在灭菌过程中，应该使用手套支撑架将手套撑开，确保手套表面能充分的暴露在灭菌气体中。验证时候需要在手套手指部分也贴上指示剂。

一般建议手套根据使用情况定期更换，尽量避免在无菌检查过程中去更换。如果在操作过程中发现手套被针头扎破，如果不是很大的破损，隔离器没有报警生成，则建议首先记录这个事件发生的时间，操作的供试品编号或者培养罐编号；同时可以在破损处做一个表面微生物留样，然后戴一层无菌手套，继续做测试。

5. 总结

隔离器的使用是一个熟悉和认知的过程，操作者需要充分了解在隔离器操作中的限制性，在正式测试前，多做几次模拟，形成一个合理的SOP，并且考虑无菌检查过程中可能出现的突发状况，在隔离器中的处理方式。在不断的实践中更好的完善操作工艺。